Microscopio

È bene che esista uno spazio libero tra il materiale da osservare e la lente dell‘obiettivo del microscopio. La distanza ideale si situa in genere tra 80 e 120 millimetri, a seconda del modello. Ci sono modelli di microscopio speciale da lavoro che hanno una distanza tra 200 e 250 millimetri. Per una buona ottica sono normalmente tra 20 e 25 millimetri con ingrandimento di 10x.

Il campo visivo è il diametro dell'immagine che possiamo vedere, ad esempio, al microscopio con ingrandimento di 10x. Questa caratteristica definisce la qualità ottica del microscopio e può essere comprovata anche da personale non specializzato. In generale, quanto più piccolo è l'ingrandimento, maggiore è il diametro del campo visivo.

Un microscopio stereo mostra spesso una profondità di campo di 10 millimetri a basso ingrandimento, aumentato notevolmente l'impressione tridimensionale dell'immagine.

Relazione tra la profondità di campo e l'ingrandimento
La profondità di campo è il range di distanza che sussiste davanti e dietro il piano focale in cui l'immagine appare "nitida". La profondità di campo dipende da vari fattori, l'ingrandimento del microscopio ha un ruolo importante nel determinare le dimensioni di questo range di distanza. In generale, quanto maggiore è l'ingrandimento, minore sarà la profondità di campo. La funzione di composizione dell'immagine ha un ruolo importante nella microscopia, e il microscopio digitale consente la creazione di immagini nitide su tutta la superficie, rendendolo decisamente più efficiace.

Sotto il tavolino del microscopio c'èil condensatore, composto da un insieme di lenti e diaframma a iride, il diaframma di apertura. La funzione di questo diaframma nel processo a luce normale consiste nella preparazione ottimale della luce del microscopio per l'obiettivo. Quando si apre il diaframma aumenta la risoluzione, mentre diminuisce il contrasto. Al contrario, quando si chiude, diminuisce la risoluzione e al contempo aumenta il contrasto. Pertanto, la funzione del diaframma di apertura consiste nel trovare il compromesso ottimale tra risoluzione e contrasto per la rispettiva preparazione. Nel microscopio a contrasto di fase o campo scuro, il diaframma di apertura non ha alcuna funzione ed è quindi completamente aperto per evitare interferenze.

Affinché sia più facile trovare di nuovo il campione dopo aver cambiato l'ingrandimento dell'obiettivo, è consigliabile posizionare il suddetto campione al centro del vetrino. Quindi regolare gli ingrandimenti dell'obiettivo muovendo il revolver. Di solito la nuova immagine appare nitida, ma se non fosse così, è possibile regolare la messa a fuoco mediante l'impostazione micrometrica del microscopio. Procedere allo stesso modo per l'obiettivo successivo più grande.

A cosa prestare attenzione con ingrandimenti più grandi
Se si lavora con ingrandimenti elevati, il diaframma del microscopio non deve essere troppo chiuso, poiché potrebbero apparire linee doppie el'immagine sfocata. In questo caso si può risolvere il problema aprendo di più il diaframma. Se succede il contrario, ovvero che il diaframma fosse aperto al massimo, l'immagine potrebbe apparire debole al punto da non distinguere quasi nulla. In tal caso sarà opportuno chiudere un poco il diaframma. Se l'immagine debole persiste dopo aver eseguito la regolazione corretta, significa che probabilmente il problema risieda nella scarsa pulizia dell'oculare o dell'obiettivo. In questo è consigliabile pulire le lenti del microscopio.

Per ottenere un'immagine nitida, chiudere il diaframma del microscopio circa a metà, e con l'aiuto del meccanismo di messa a fuoco macro muovere lentamente l'obiettivo più piccolo del microscopio mentre allo stesso tempo si osserva attraverso l‘oculare. Quando si possono distinguere le celle attraverso l'obiettivo, regolare con precisione la nitidezza dell'immagine con il meccanismo di messa a fuoco micro. Regolare anche la luminosità dell'immagine con il tasto di regolazione apposito fino a ottenere una intensità luminosa adeguata. Se il microscopio non dispone della funzione di luminosità regolabile e l'immagine è troppo chiara, chiudere un poco più il diaframma. Se l'immagine è troppo scura, sarà invece necessario aprirlo.

Nel nostro canale YouTube si può trovare il video del nostro microscopio PCE-MM 200. Nel video possiamo apprezzare quanto è facile osservare le superfici con un microscopio USB per PC. Il microscopio USB fa vedere gli oggetti in tempo reale fino a 200 ingrandimenti sullo schermo del PC. Si ottengono immagini luminose grazie agli 8 LED incorporati che illuminano da tutti gli angoli, e si può regolare la luce di forma continua. Si può utilizzare questo microscopio, ad esempio, nella didattica, per far vedere ai bambini i dettagli non visibili nelle piante, piccoli oggetti o miniature. Si può usare questo microscopio USB anche come aiuto per collezionisti di monete o francobolli. Il software offre molteplici applicazioni che consentono di impostare il microscopio con una piccola dima in millimetri e pollici. Così è possibile misurare comodamente le distanze nel PC. Si possono trovare ulteriori informazioni sul nostro microscopio USB in questo report.

Le applicazioni di un microscopio, analogico o digitale, sono praticamente illimitate.

Con l'uso del microscopio possono succedere spesso due tipi di errori determinati:

- Si è regolato un ingrandimento troppo elevato. Per l'osservazione di sezioni di oggetti semplici, trasparenti, è sufficiente per il principiante un ingrandimento tra 50x e 300x. Solo con l'osservazione di oggetti tagliati con un microtomo e che sono disconseguenza molto sottili, è conveniente un ingrandimento superiore. Allo stesso modo si useranno ingrandimenti molto elevati (x 1.000 e oltre) per l'osservazione delle analisi del sangue.

- Il preparato si deteriora con una errata regolazione dell'obiettivo. Con ingrandimenti superiori può regolare per prima cosa la luminosità prima che l'obiettivo influisca sul preparato. Pertanto, per una giusta regolazione, l'obiettivo verrà diretto chiuso sul preparato. Poi si potrà vedere con l'oculare e regolare con cura la luminosità.

Esempio di utilizzo di un microscopio nel campo dell'elettronica
In elettronica, il microscopio viene utilizzato per un'ampia varietà di applicazioni. I microscopi digitali fissi si utilizzano nel controllo di qualità dell'attività produttiva e nel montaggio delle piastre. Rispetto ai microscopi ottici, hanno il vantaggio di offrire migliori possibilità di orientamento, consentnedo di ispezionare la piastra segmento per segmento. L'ispezione può essere visualizzata direttamente su un grande schermo e, grazie alle opzioni di memorizzazione (solitamente su scheda SD), può anche essere documentata. In base al tipo di microscopio, è possibile memorizzare foto e in alcuni altri anche video. Le piastre vengono controllate per rilevare cortocircuiti e interruzioni di pista. Il microscopio viene utilizzato anche per confrontare i contorni dei percorsi del conduttore con le specifiche del modello. È possibile controllare la continuità e i residui dei fori e delle vie.

La vernice resistente alla saldatura viene sottoposta a un'ispezione ottica al microscopio per garantire che si diffonda in modo uniforme e non formi macchie. Una volta che le piastre sono state pulite e assemblate, vengono riesaminate al microscopio. Nel caso di circuiti integrati con una piccola distanza tra i pin, viene prima verificato se i pin si trovano sulla superficie di contatto corrispondente e se si sono formati dei cortocircuiti sui pin del bagno di saldatura. Nel caso di Surface Mount Device (SMD) il microscopio viene utilizzato per controllare i componenti corretti, poiché la loro iscrizione non può essere vista con l'occhio umano.

Ovviamente, vengono esaminati anche i giunti di saldatura per vedere se vi sono rotture di saldatura e nei cosiddetti giunti di saldatura fredda. I giunti di saldatura a freddo non hanno collegamento tra la saldatura e il pin di connessione del componente corrispondente. Il rilevamento dei giunti saldati a freddo è spesso molto difficile perché sono difficili da vedere. Senza l'uso di un microscopio raramente si può rilevare. La rilevazione dei giunti saldati a freddo è molto importante perché spesso sono fonte di assemblaggi elettronici non più o solo parzialmente funzionali.

Il microscopio viene utilizzato anche nella manutenzione e riparazione di assemblaggi elettronici. Tuttavia, dal momento che spesso è difficile smontare la piastra, si utilizza in genere un microscopio digitale portatile e piccolo. Questo può avere un collegamento USB in modo che il monitor del PC possa fungere da schermo, o integrare direttamente uno schermo nel microscopio. Come nella produzione, le piastre vengono controllate anche per saldature rotte o fredde, o potenziali cortocircuiti o interruzioni involontarie del percorso del conduttore verificate durante l'uso. Inoltre, i componenti vengono esaminati per possibili crepe o deformazioni termiche.

Un requisito fondamentale per ottenere immagini nitide è che l'ottica sia sempre pulita. Il maggiore problema è costituito dalla polvere. Da una parte disturba al momento di visualizzare l'immagine e dall'altra riga la superficie di vetro, danneggia l'ingranaggio e la superficie di scivolamento. Perciò, proteggere i microscopi dalla polvere è una delle misure più importanti per prevenire danni. Per ciò, è importante coprire i microscopi con una coperta soffice e facile da pulire dopo ogni uso per evitare che la polvere penetri fino al microscopio. È importante differenziare la classe di sporcizia al momento di pulire i componenti ottici: particelle di polvere (residui di vetro dei copri-oggetti, resti di tessuto, etc.) e sporcizia in generale (orme digitali, etc).

I microscopi sono strumenti che permettono di osservare oggetti che sono troppo piccoli per essere visto a prima vista. Il più comune di essi è il microscopio ottico che è basato su normali lenti ottiche.

I microscopi moderni possono essere costituiti da diversi componenti. La figura seguente illustra i componenti più importanti. I microscopi con fotocamera hanno spesso un display LCD invece di un oculare.

1. Oculare
2. Stativo /supporto del tubo
3. Tavolino portaoggetti
4. Regolatore macrometrico e micrometrico
5. Regolatore dell'altezza del tavolino portaoggetti
6. Base
7. Fonte di luce
8. Condensatore
9. Pinze
10. Obiettivo
11. Revolver
12. Tubo

Il supporto del microscopio contiene i seguenti componenti:

Il basamento è la base del microscopio, su cui sono strutturati gli altri componenti. Il supporto del tubo è una colonna, su cui si tengono l'ottica e il palco. Il tubo è quasi sempre in obliquo, raramente verticale, nella parte superiore del microscopio. Il supporto da lavoro, che ha un foro al centro, è chiamato palco. Per regolare la nitidezza, ci sono due rotelle, la rotella di regolazione macrometrica e la rotella di regolazione micrometrica. Tutti gli altri componenti del microscopio utilizzati per l'illuminazione e l'ingrandimento sul campione fanno parte dell'ottica. Si guarda attraverso l'oculare all'estremità del tubo. Sul campione ci sono gli obiettivi, fissi al revolver, che serve a cambiarli istantaneamente. Sotto il palco del microscopio c'è un sistema di lenti chiamato condensatore. Per illuminare i campioni vengono utilizzati la fonte di luce o lo specchio.

• Collocare il microscopio in posizione retta e stabile


• Collegare il microscopio alla corrente elettrica


• Abbassare il palco alla posizione più bassa


• Selezionare l'obiettivo più piccolo del revolver


• Collocare il vetrino in modo tale da posizionare il campione al centro del palco


• Alzare il palco verso l'obiettivo. Osservare su un lato che il vetrino non tocchi l'obiettivo
• Correggere l'illuminazione con il diaframma. Più chiuso è il diaframma, più nitida sarà l'immagine
• Adesso selezionare l'obiettivo più grande. Il campione si deve vedere con chiarezza. In caso contrario, centrarlo di nuovo usando un obiettivo più piccolo
• Mettere a fuoco con cura, poiché la distanza dal campione è inferiore. Illuminare un poco con il diaframma
• Mettere a fuoco l'immagine ruotando al minimo la regolazione macrometrica e micrometrica
• Potrebbe essere necessario spostare leggermente il vetrino per centrare il campo visivo

Un microscopio stereo viene utilizzato principalmente per osservare le caratteristiche interne di un oggetto. L'uso dell'ottica stereo consente ai nostri occhi di vedere l'immagine dello stesso oggetto da due diverse angolazioni. Questo crea un'impressione tridimensionale, cioè un'impressione spaziale.

Il colore verde delle foglie delle piante è prodotto normalmente dalla clorofilla che vi è contenuta. Le foglie delle piante diventano fluorescenti in modo naturale quando vengono eccitate da intensa luce rossa a onda corta. Per questo motivo non è necessaria alcuna preparazione preventiva della foglia per osservare la fluorescenza al microscopio. Nella fluorescenza secondaria gli oggetti non fluorescenti sono marcati con un colorante fluorescente. Un colorante fluorescente noto è, ad esempio, l'arancio acridina, con il quale i nuclei cellulari (cromatina e nucleolo) mostrano una fluorescenza verde all'eccitazione con luce blu. Poiché la fluorescenza si verifica solo con l'applicazione del colorante fluorescente, in questo caso si parla di fluorescenza indotta.

L'immunofluorescenza è una tecnica in cui si unisce un colorante fluorescente (generalmente FITC = isotiocianato di fluoresceina) a un anticorpo. Gli anticorpi possono essere prodotti in un modo molto specifico per determinate strutture biologiche. Il legame del fluorocromo avviene grazie all'anticorpo. Queste fluorocromazioni sono estremamente selettive, tuttavia non sono così intense come la fluorescenza secondaria tradizionale.

Microscopio stereo a luce riflessa
Questo tipo di microscopio si utilizza principalmente per visualizzare oggetti di dimensioni più grandi. I campi in cui si utilizzano sono ad esempio l'analisi di insetti, piante, monete o controllo dei materiali. Questo microscopio a luce riflessa opera in genere a una distanza operativa di oltre 40 mm, ed è ideale per lavorare con grandi oggetti o per il controllo dei materiali. Questo microscopio viene proposto normalmente come binoculare.

Microscopio digitale
La microscopia digitale è l'opposto della microscopia convenzionale. I campioni non vengono analizzati direttamente attraverso l'oculare del microscopio, ma vengono visualizzati su schermo con la risoluzione richiesta, completamente scannerizzata, come immagine completa e virtuale. La funzione integrata di messa a fuoco automatica automático nell'obiettivo del microscopio, garantische un'immagine sempre nitida e chiara. Le singole immagini prodotte dalla scannerizzazione, si sovrappongono in modo automatico per riprodurre un'immagine finale completa. Questa immagine finale e virtuale si può memorizzare in un database.

Microscopio a luce trasmessa
Questo microscopio viene utilizzato soprattuto nell'osservazione di preparati traslucidi e liquidi: nell'analisi del sangue, cellule, prove su piante, ecc. Un tipico microscopio a luce riflessa ha una distanza operativa corta, sotto i 4 mm, e per questo motivo è un tipo di microscopio adatto solo all'analisi di piccoli campioni.

I campioni vengono posti su un vetrino e coperti. Al contrario, il microscopio a luce trasmessa di solito ha obiettivi con ingrandimenti elevati (da 40x a oltre 1000x). Quando si lavora a 1000x o superiore, è necessario mettere una goccia di olio per immersione per chiudere lo spazio d'aria tra il vetrino e la lente dell'obiettivo, per ottenere così una nitidezza utile. Le immagini fino a 400x possono essere visualizzate con quasi tutti i microscopi senza la necessità di tecniche speciali come quella sopra descritta. Cambiando gli oculari, è possibile aumentare l'ingrandimento del microscopio a luce trasmessa.

Microscopio elettronico
Rispetto alla qualità, il microscopio elettronico è superiore a un tipico microscopio a luce visibile (fotoni). Questo microscopio aumenta la velocità degli elettroni per ottenere una lunghezza d'onda più corta e ottenere una maggiore risoluzione (dal momento che gli elettroni hanno una lunghezza d'onda abbastanza più corta della luce visibile e pertanto possono dsigregare strutture più piccole), per avere una capacità di ingrandimento fino a 500.000 ingrandimenti, assai maggiore se comparato ad altri tipi di microscopio ottico. Le immagini originali ottenute sono in bianco e nero perché si utilizzano elettroni invece della luce. Il fascio elettronico si produce attraverso un catododi tungsteno. Ci sono due tipi di microscopio che operano in base a questo principio: microscopio elettronico a trasmissione e microscopio elettronico a scansione.

La migliore risoluzione di un moderno microscopio è al massimo di 200 nm con il SEM a 3 nm e con il TEM anche a 0.2 nm. Per vedere strutture ancora più sottili, è possibile utilizzare un microscopio a effetto tunnel o un microscopio a forza atomica.

Varianti della microscopia elettronica:
La Microscopia Elettronica a Trasmissione (TEM)
Qui gli elettroni passano attraverso un oggetto sottile. Il microscopio TEM corrisponde sostanzialmente alla microscopia a luce trasmessa, dove l'assrobimento gioca un ruolo determinante. La risoluzione è attualmente di circa 0,05 nm.

Il microscopio elettronico a scansione (SEM – Scanning Elektron Microscopy)
Un fascio di elettroni finemente raggruppato viene guidato su uno specifico reticolo sopra il campione rivestito di metallo prezioso. Gli elettroni secondari (contrasto) emessi dalla superficie dell'oggetto vengono misurati come segnale e convertiti in un'immagine ottica. Per ottenere un fascio di elettroni senza disturbi, la misurazione viene eseguita in alto vuoto.

Il microscopio a forza atomica (AFM – Atomic Force Microscopy)
Questo metodo si impiega per il rendering della superficie. Con un ago "atomico" attaccato a una balestra, il campione viene scansionato su una griglia definita. Le forze atomiche mantengono costante la distanza dalla superficie. La flessione della molla viene registrata dai sensori ottici per riflessione della luce laser e viene visualizzata linea per linea. A seconda della rugosità da testare, vengono registrate differenze laterali nel range di 0,1 - 10 nm.

Il microscopio a effetto tunnel (STM – Scanning Tunnelling Microscopy)
Nella microscopia a effetto tunnel, le superfici vengono visualizzate misurando il flusso di corrente tra una punta elettricamente conduttiva e il campione ugualmente conduttivo. I campioni non conduttivi devono essere vaporizzati con oro, grafite o cromo. Anche qui la punta viene guidata sull'oggetto su una griglia specifica.

Monoculare, binoculare e trinoculare
Il microscopio monoculare è il più economico e adatto per introdursi nel mondo della microscopia. Con il microscopio monoculare non si perde visibilità poiché si utilizza un solo obiettivo. Per una visione più lunga e più rilassata, è meglio lavorare con il microscopio binoculare. Utilizzando entrambi gli occhi, la vista è più rilassata per un lungo periodo di tempo. Oltre agli elementi standard, il microscopio binoculare ha una disposizione dei prismi più complessa e un'illuminazione più potente. Per le applicazioni che richiedono il salvataggio delle immagini, è consigliabile il microscopio trinoculare. È un microscopio binoculare con un terzo tubo aggiuntivo. Ciò consente di collegare una fotocamera con una connessione USB (chiamata anche microoculare) che registra le immagini. Le immagini registrate possono essere trasferite su un computer. C'è anche la possibilità di collegare un microoculare al microscopio binoculare posizionandolo in uno degli oculari del microscopio. Il microoculare offre la possibilità di trasformare economicamente il microscopio analogico in un microscopio digitale.

Il microscopio a raggi X
Nella microscopia a raggi X, i raggi X vengono utilizzati come sorgente di radiazione. A causa della minor lunghezza d'onda dei raggi X, la risoluzione è molto maggiore della luce. Si possono misurare anche altre interazioni (capacità di penetrazione) del campione con i raggi X. Un grande vantaggio della microscopia a raggi X consiste nel fatto che i campioni possono essere più spesso rispetto alla microscopia elettronica. Allo stesso modo, non è necessaria la conduttività elettrica della superficie, il materiale biologico non deve essere colorato, incrostato in un altro materiale di supporto o tagliati in campioni sottili.

Il microscopio confocale
Questo tipo di microscopio è una forma speciale di microscopia a luce o fluorescenza: sezioni ottiche molto sottili vengono "scansionate" e assemblate in un'immagine 3D. Poiché tutte le sezioni sono otticamente nitide, viene creata un'immagine 3D completamente a fuoco.

Per le applicazioni che devono essere catturate in immagini, ci sono anche microscopi trinoculari o microscopi con fotocamera. Sono microscopi binoculari con un tubo aggiuntivo. Qui è possibile collegare una fotocamera USB durante l'osservazione. Le immagini registrate possono essere trasferite su un PC. Inoltre, c'è la possibilità di collegare un microoculare a microscopi binoculari. Questo microoculare si inserisce semplicemente nel supporto dell'oculare del microscopio. Il microoculare offre la possibilità di aggiornare i microscopi esistenti a un videomicroscopio o a un microscopio con fotocamera a un prezzo ragionevole e quindi aggiornarli allo stato della tecnica attuale.

Requisiti del microscopio
A seconda dell'uso, il microscopio dovrà rispettare determinati requisiti. Un microscopio normale, con 400x o 600x e illuminazione, è sufficiente per un utilizzo di base. Un microscopio con illuminazione speciale, come contrasto a fase, a capo scuro o illuminazione alogena potente, consente un riconoscimento dettagliato degli oggetti, senza la necessità di colorare il campione.