Microscopio

La utilización de luz monocromática con longitud de onda corta causa una mayor resolución. En el rango UV se consigue una resolución especialmente alta con luz, ya que por una parte la longitud de onda corta de la luz UV ya produce una resolución alta y por otra parte la luz UV es absorbida por la muestra (por ejemplo por proteínas y aminoácidos); De esta manera también se obtiene más contraste que con otras longitudes de onda. Organelas y pequeñas estructuras son claramente visibles bajo el microscopio incluso sin procedimiento de contraste adicional.

Con un microscopio podemos ver o representar objetos o materiales con múltiples ampliaciones. Por ejemplo, se pueden observar y estudiar en la pantalla LCD los objetos más pequeños, plantas o insectos. El microscopio era y es una herramienta esencial en la biología, medicina y ciencia de los materiales. Un microscopio se compone esencialmente de dos piezas ópticas, el objetivo y el ocular, conectados por el tubo, un dispositivo de iluminación así como la platina y el trípode de soporte de los componentes ópticos.

El dispositivo de iluminación del microscopio de luz reflejada se suele componer de una lámpara de microscopio incorporada en el trípode, ajustable hacia el colector (lente o sistema de lentes justo delante de la bombilla) y la compuerta del campo luminoso detrás de éste. El condensador del microscopio de luz reflejada suele ser un sistema complejo de lentes o espejos, que proyecta el diafragma de campo en el plano del objeto. El objetivo del microscopio genera una imagen real aumentada del objeto, el cual puede observarse aumentado a su vez por el ocular. Para observar el objeto con ambos ojos, el microscopio se dota de dos oculares (microscopio binocular).

Información adicional sobre conceptos importantes de la microscopía:

Aumento del microscopio

El aumento del microscopio es el producto de la multiplicación del aumento del objetivo con el aumento del ocular. Ejemplo: microscopio de zoom estéreo: Ocular 12,5 aumentos y zoom del objetivo 0,8 hasta 4,0 aumentos producen un aumento total de entre 10 y 50 aumentos etc.

Aumento zoom

La mayoría de los modelos de microscopio estéreo ofrecen una posibilidad de ajuste del aumento continua, variable con anillo estriado en el exterior.

Distancia de trabajo

Es bueno si existe una distancia de trabajo entre el material a observar y la lente del objetivo inferior del microscopio. Por lo general lo ideal es entre 80 y 120 milímetros según el modelo de microscopio. El microscopio especial de trabajo ofrece una distancia de entre 200 y 250 milímetros. Para una buena óptica lo normal son entre 20 y 25 milímetros con un aumento de 10.

Campo de visión

El criterio es el diámetro de la imagen del microscopio observada con un aumento de 10. Es una característica de calidad de cada óptica y puede ser comprobado incluso por personal no especializado. Norma general: En cuanto más pequeño es el aumento, mayor es el diámetro del campo de visión.

Relación entre la profundidad de campo y aumento

La nitidez de profundidad es el rango de la distancia por delante y detrás del plano focal, en el que la imagen aparece "nítida". Mientras que la nitidez de profundidad depende de diferentes factores, el aumento del microscopio juega un papel importante en la determinación de la magnitud de este rango de distancia. Por lo general: A mayor aumento, menor nitidez de profundidad. La función de composición de la imagen juega un papel importante en la microscopía, y el microscopio digital posibilita una generación de imágenes nítidas en toda la superficie claramente más eficiente.

Nitidez de profundidad

A menudo en caso de un aumento pequeño un microscopio estéreo muestra una nitidez de profundidad de 10 milímetros, que la impresión de la imagen plástica aumenta considerablemente.

Ajustar la resolución y el contraste de la imagen microscópica

Debajo de la platinadel microscopio se encuentra el condensor, que se compone de un sistema de lentes y un diafragma de iris. La función de este diafragma en el procedimiento de luz normal es la preparación óptima de la luz del microscopio para el objetivo correspondiente. Si se abre la apertura del diafragma del microscopio, aumenta la resolución con el contraste decreciente.Al cerrarlo se puede observar como por el contrario, disminuye la resolución con un aumento simultáneo del contraste. La función de apertura del diafragma es por tanto ajustar para la muestra correspondiente un compromiso óptimo entre la resolución y el contraste. En el caso de un microscopio de contraste de fase o de campo oscuro la apertura del diafragma no tiene ninguna función y por eso en este procedimiento de contraste se abre completamente para evitar averías.

Cambiar el microscopio a objetivos más grandes

Sitúe las células de su muestraque desea observar con más aumentos en el centro de la imagen, para que cuando cambie el objetivo la encuentre nuevamente. Cambie el objetivo del microscopio moviendo el revólver. Casi siempre sucede que la nueva imagen es nítida. El ajuste de la nitidez lo consigue mediante el ajuste micrométrico del microscopio. Siga el mismo procedimiento para poner un objetivo con más aumentos aún.

A tener en cuenta al trabajar con grandes aumentos

Al trabajar con grandes aumentos el diafragma del microscopio no debe estar demasiado cerrado, pues esto puede producir que se vean líneas dobles y la imagen no sea nítida. En ese caso debe abrir más el diafragma. En caso que el diafragma estuviera abierto del todo, la imagen puede aparecer de forma débil, hasta el punto que no se pueda reconocer casi nada. En ese caso deberá cerrar un poco el diafragma. Si después de efectuar un ajuste correcto sigue teniendo una imagen débil, probablemente el problema sea que el ocular o el objetivo del microscopio estén sucios. En ese caso deberá limpiar los lentes correspondientes.

Ajuste de una imagen nítida

Cierre el diafragma en el condensador hasta la mitad. Mueva lentamente con ayuda del mecanismo de enfoque macro el objetivo más pequeño del microscopio sobre la muestra, a la vez que observa a través del ocular. Cuando pueda reconocer las células de su objetivo, ajuste la nitidez de la imagen de forma precisa con el mecanismo de enfoque micro. Ajuste así mismo la claridad con el botón de ajuste para la iluminación una intensidad de luz adecuada para usted. Si su microscopio dispone de una iluminación regulable, cierre el diafragma en el condensador un poco más, si la imagen es demasiado clara, o ábralo si la imagen es demasiado oscura.

Este video muestra cómo observar las superficies con el microscopio USB para PC. El PCE-MM 200 muestra los objetos en tiempo real con hasta 200 aumentos en la pantalla del PC. Esto proporciona imágenes brillantes obtenidas mediante los 8 LED incorporados. El objeto se ilumina desde todos los ángulos. Además, la regulación de la luz en continua. También puede utilizar el microscopio como una cámara web. Puede utilizar este microscopio, por ejemplo en el campo de la educación, para que los niños observen los detalles no visibles en las plantas, objetos pequeños o miniaturas. También se puede utilizar el microscopio PCE-MM 200 como ayuda para los coleccionistas de monedas o sellos. Otra aplicación es el software que le permite ajustar el microscopio con un pequeño patrón en milímetros y pulgadas. Esto permite medir distancias de manera cómoda en su PC. Más información sobre nuestro microscopio USB.

El campo de uso del microscopio es prácticamente ilimitado.

También existen componentes adicionales para el microscopio: software-kit (software y cable de datos) para la transmisión directa de la visualización al PC.

Utilización del microscopio

Con el uso del microscopio puede ocurrir a menudo dos fallos determinantes:

- Se ha ajustado un aumento demasiado elevado. Para la observación de secciones de objetos sencillos, transparentes es suficiente para el principiante un aumento de entre 50x y 300x. Sólo con la observación de objetos cortados con un microtomo y que son por consiguiente muy delgados, es conveniente un aumento superior. Asimismo se utilizarán aumentos muy elevados (x 1.000 y mayor) para la observación de análisis de sangre.

- El preparado se deteriora con un falso ajuste del objetivo del microscopio. Con aumentos superiores puede ajustar primero brevemente la claridad antes de que el objetivo afecte al preparado. Por lo tanto, para un ajuste apropiado, el objetivo se dirigirá cerrado sobre el preparado. Después se podrá ver con el ocular y ajustar con cuidado la claridad.

Puede ver una selección de nuestros microscopios en uso práctico

Limpieza del microscopio

Un requisito para obtener imágenes nítidas es que la óptica del microscopio esté limpia. El mayor problema lo constituye el polvo. Por un lado estorban a la hora de visualizar la imagen con el microscopio, y por otra parte rayan la superficie de vidrio y dañan el engranaje y la superficie de deslizamiento del microscopio. Así pues, proteger el microscopio del polvo es una de las medidas más importantes para prevenir daños en el microscopio. Por ello, es importante de cubrir el microscopio con una cubierta suave y fácil de limpiar después de cada uso, y limpiar de forma regular la cubierta para evitar que el polvo penetre hasta el microscopio. Es importante que las aperturas en el porta prismas también estén siempre tapadas. Es importante diferenciar la clase de suciedad a la hora de limpiar los componentes ópticos del microscopio: partículas de polvo (residuos de vidrio de los cubreobjetos, restos de textil, etc.) y suciedad en general (huellas dactilares, etc).

Partes esenciales del microscopio

El microscopio moderno puede estar compuesto de diferentes componentes. En la imagen contigua se enumeran las partes más importantes del microscopio. El microscopio con cámara dispone con frecuencia de una pantalla LCD en vez de un ocular.

El microscopio contienen los siguientes componentes:

El pie es la base del microscopio, sobre las que se estructuran los demás componentes. El soporte del tubo es una columna, sobre la que se sujetan la óptica y la platina. El tubo está casi siempre situado de forma oblicua, rara vez de forma vertical, en la parte superior del microscopio. El soporte para trabajar, que tiene una perforación en el centro se denomina platina. Para el ajuste de la nitidez normalmente dispone de dos ruedas, la rueda de ajuste macrométrico y la de ajuste micrométrico. Todos los demás componentes del microscopio que se utilizan para la iluminación y el aumento sobre la muestra, forman parte de la óptica. Se mira a través del ocular que se encuentra en el tubo. Sobre la muestra se encuentran los objetivos sujetos al revolver para cambiarlos de forma instantánea. Por debajo de la platina del microscopio se encuentra un sistema de lentes llamado condensador. Para iluminar las muestras se usa la fuente de luz o un espejo.

Observaciones para el uso de un microscopio:

- Coloque el microscopio de forma recta y segura.
- Conecte el microscopio a la red eléctrica.
- Descienda la platina a su posición más baja.
- Seleccione el objetivo más pequeño del revólver.
- Coloque el portaobjetos de tal forma que el objeto esté situado en el centro de la platina.
- Suba la platina hacia el objetivo. Observe por el lateral que no se aplaste el cubre objetos de cristal.
- Corrija la iluminación con el diafragma. Cuanto más cerrado esté el diafragma, más nítida será la imagen.
- Seleccione ahora el objetivo más grande. El objeto se debe poder ver de forma clara. Caso contrario, céntrelo nuevamente usando un objetivo más pequeño.
- Enfóquelo con cuidado, pues la distancia al objeto es inferior. Ilumínelo un poco con el diafragma.
- Focalice la imagen girando mínimamente el ajuste macrométrico y micrométrico
- Tal vez sea necesario desplazar un poco el portaobjetos para centrar el campo de visión.

Los microscopios estereoscópicos se usan principalmente para observar las características interiores de un objeto. El uso de una óptica estéreo permite que nuestros ojos vean la imagen del mismo objeto desde dos ángulos diferentes. Esto crea una impresión tridimensional, es decir, una impresión espacial.

Aumento del microscopio

El aumento del microscopio es el producto de la multiplicación del aumento del objetivo con el aumento del ocular. Ejemplo: microscopio de zoom estéreo: Ocular 12,5 aumentos y zoom del objetivo 0,8 hasta 4,0 aumentos producen un aumento total de entre 10 y 50 aumentos etc.

Aumento Zoom

La mayoría de los modelos de microscopio estéreo ofrecen una posibilidad de ajuste del aumento continua, variable con anillo estriado en el exterior.

Profundidad de campo

Los microscopios estereoscópicos muestran con frecuencia con pocos aumentos una profundidad de campo de 10 mm, lo que aumenta considerablemente el efecto de una imagen plástica.

Distancia de trabajo

Es bueno si existe una distancia de trabajo entre el material a observar y la lente del objetivo inferior del microscopio. Por lo general lo ideal es entre 80 y 120 milímetros según el modelo de microscopio. El microscopio especial de trabajo ofrece una distancia de entre 200 y 250 milímetros. Para una buena óptica lo normal son entre 20 y 25 milímetros con un aumento de 10.

Campo de visión

El criterio es el diámetro de la imagen del microscopio observada con un aumento de 10. Es una característica de calidad de cada óptica y puede ser comprobado incluso por personal no especializado. Norma general: En cuanto más pequeño es el aumento, mayor es el diámetro del campo de visión.

Relación entre la profundidad de campo y aumento

La nitidez de profundidad es el rango de la distancia por delante y detrás del plano focal, en el que la imagen aparece "nítida". Mientras que la nitidez de profundidad depende de diferentes factores, el aumento del microscopio juega un papel importante en la determinación de la magnitud de este rango de distancia. Por lo general: A mayor aumento, menor nitidez de profundidad. La función de composición de la imagen juega un papel importante en la microscopía, y el microscopio digital posibilita una generación de imágenes nítidas en toda la superficie claramente más eficiente.

Ajustar la resolución y el contraste de la imagen microscópica

Debajo de la platina del microscopio se encuentra el condensor, que se compone de un sistema de lentes y un diafragma de iris. La función de este diafragma en el procedimiento de luz normal es la preparación óptima de la luz del microscopio para el objetivo correspondiente. Si se abre la apertura del diafragma del microscopio, aumenta la resolución con el contraste decreciente. Al cerrarlo se puede observar como, por el contrario, disminuye la resolución con un aumento simultáneo del contraste. La función de apertura del diafragma es por tanto ajustar para la muestra correspondiente un compromiso óptimo entre la resolución y el contraste. En el caso de un microscopio de contraste de fase o de campo oscuro la apertura del diafragma no tiene ninguna función y por eso en este procedimiento de contraste se abre completamente para evitar averías.

Lo que debe tener en cuenta a la hora de trabajar con un microscopio

- Los oculares y objetivos del microscopio deben estar limpios. Sino la imagen no será nítida.
- Accione la iluminación.
- Sitúe el objetivo más pequeño sobre la platina.
- Debería estar colocado el objetivo más pequeño sobre la platina.
- Sitúe el preparado colocado en el porta muestras en el centro sobre el condensador.

Ajuste de una imagen nítida

Cierre el diafragma en el condensador hasta la mitad. Mueva lentamente con ayuda del mecanismo de enfoque macro el objetivo más pequeño del microscopio sobre la muestra, a la vez que observa a través del ocular. Cuando pueda reconocer las células de su objetivo, ajuste la nitidez de la imagen de forma precisa con el mecanismo de enfoque micro. Ajuste así mismo la claridad con el botón de ajuste para la iluminación una intensidad de luz adecuada para usted. Si su microscopio dispone de una iluminación regulable, cierre el diafragma en el condensador un poco más, si la imagen es demasiado clara, o ábralo si la imagen es demasiado oscura.

Fluorescencia

El color verde de las hojas de las plantas (clorofila) con la excitación de forma natural con luz de onda corta fluorece en luz intensiva roja. Para la observación de esta fluorescencia primaria con los microscopios no es necesario ninguna preparación. En una fluorescencia secundaria se marcan los objetos que no fluorecen con un colorante fluorescente. Un colorante fluorescente conocido es por ejemplo Acridinorange, que con la excitación del núcleo de la célula con luz azul, muestra una fluorescencia verde. Debido a que la fluorescencia se produce sólo con la preparación del colorante fluorescente, se habla también de fluorescencia inducida.

En la fluorescencia inmune se acopla un colorante fluorescente (casi siempre FITC = Fluorescein-iso-thio-cyanat) con un anticuerpo. Estos anticuerpos se pueden producir de forma muy específica para determinadas estructuras biológicas. La unión del colorante se transmite prácticamente a través del anticuerpo. Estas coloraciones son extremadamente selectivas, sin embargo, no tan intensivas como en la fluorescencia secundaria tradicional.

Cambio en el microscopio a objetivos mayores

Sitúe las células de su muestra que desea observar con más aumentos en el centro de la platina, para que cuando cambie el objetivo la encuentre nuevamente. Cambie el objetivo del microscopio moviendo el revolver. Casi siempre sucede que la nueva imagen es más nítida. El ajuste de la nitidez lo consigue mediante el ajuste micrométrico. Siga el mismo procedimiento para poner un objetivo con más aumentos aún.

A tener en cuenta al trabajar con grandes aumentos

Al trabajar con grandes aumentos el diafragma del microscopio no debe de estar demasiado cerrado, pues esto puede producir que se vean líneas dobles y la imagen no sea nítida. En ese caso debe abrir más el diafragma. En caso que el diafragma estuviera abierto del todo, la imagen puede aparecer de forma débil, hasta el punto que no se pueda reconocer casi nada. En ese caso deberá cerrar un poco el diafragma. Si después de efectuar un ajuste correcto sigue teniendo una imagen débil, probablemente el problema sea que el ocular o el objetivo del microscopio esté sucio. En ese caso deberá limpiar los lentes correspondientes.

Microscopios estéreo de luz reflejada y luz transmitida

Este microscopio se usa principalmente para visualizar objetos mayores. El ámbito de uso es por ejemplo el análisis de insectos, plantas, monedas o la comprobación de materiales. La mayoría de los microscopios de luz reflejada tienen una distancia de trabajo de más de 40 mm. Por ello, este microscopio es ideal para trabajar con objetos grandes o para la comprobación de materiales. Normalmente se oferta este microscopio como modelos binoculares.

Microscopio digital

La microscopía digital es la pareja de la microscopía convencional. Las pruebas no se analizan directamente a a través del ocular de los microscopios, sino que se presentan como imagen completa virtual, que después de escanear completamente la prueba se muestra en pantalla con la resolución deseada. Un auto foco integrado garantiza que la imagen esté situada siempre en el foco, y por tanto sea nítida. Las imágenes producidas mediante el escaneo se solapan de forma >automática para producir finalmente una imagen completa. La imagen final virtual se puede grabar en una base de datos.

Microscopio de luz reflejada

Este microscopio se usa principalmente para observar preparados transparentes y líquidos. El ámbito de uso son por ejemplo el análisis de sangre, células, pruebas en plantas. El microscopio clásico de luz reflejada tienen una distancia de trabajo muy ínfima, por debajo de 4 mm. Por ello, esta clase de microscopio son aptos para preparados muy finos.

Los preparados se ponen encima del porta muestras y se tapan con el cubre muestras. El microscopio de luz reflejada se ofrece normalmente con muchos aumentos (de 40 hasta más de 1000 aumentos). En trabajos con 1000 aumentos es necesario poner una gota de aceite de inmersión para cerrar el espacio de aire entre el porta muestras y el cubre muestra. Imágenes hasta 400 aumentos se pueden ver con cualquier aparato sin necesidad de alguna técnica en especial. Con el cambio de los oculares se puede incrementar los aumentos del microscopio de luz reflejada.

Microscopio electrónico

Es el microscopio que utiliza electrones en lugar de luz visible (fotones) para formar imágenes de objetos pequeños. Este tipo de microscopio aumenta la velocidad de los electrones para obtener una longitud de onda más corta y conseguir una resolución mayor (los electrones poseen una longitud de onda bastante inferior que la luz visible, y por tanto pueden disgregar estructuras muy pequeñas) consiguiendo con ello una capacidad de aumente de hasta 500.000 aumentos en comparación con otros tipos de microscopios óptico. Las imágenes originales obtenidas son en blanco y negro pues se usan electrones en vez de luz. El haz electrónico se produce mediante un cátodo de Wolframio. Existen dos tipos de microscopios que trabajan según este principio: de transmisión y microscopio electrónico de barrido

La mejor resolución de microscopios modernos también es en el mejor de los casos de 200 nm, y con el REM 3 nm, y con el TEM incluso 0,2 nm. Para obtener estructuras más finas puede usar un microscopio con efecto túnel o un microscopio de fuerza atómica.

Mono, Bino o Trinocular

El microscopio monocular es el más económico para introducirse en el mundo de la microscopía. No pierde visibilidad por usar un sólo objetivo. Para una visualización prolongada y más relajada conviene trabajar con el microscopio binocular. Al usar ambos ojos, la vista está más relajada durante un espacio de tiempo prolongado. El microscopio binocular tiene, además de elementos normalizados, una disposición de prismas más compleja y una iluminación más potente.

Para aplicaciones que requieren guardar imágenes existe el microscopio trinocular. Se trata de un microscopio binocular con un tubo adicional. Este le permite situar una cámara USB que registra las imágenes. Las imágenes registradas las puede transmitir a continuación a un PC o portátil. También tiene la posibilidad de conectar un micro ocular al microscopio binocular. Este micro ocular se coloca simplemente en uno de los oculares del microscopio. El micro ocular le ofrece la posibilidad de transformar de forma económica el microscopio en videos microscopios.

Exigencias al microscopio

Dependiendo del uso que le vaya a dar, pondrá más o menos exigencias al equipamiento. Un microscopio normal con 400 o 600 aumentos suele tener una iluminación suficiente. La iluminación especial como un contraste de fase, de campo oscuro e iluminación potente halógena permiten un reconocimiento de detalles de objetos sin contraste, sin la necesidad de tintar el preparado.

Microscopio y microscopio de cámara incorporada en la PTB (Instituto Federal de Física y Meteorología).